实时图像的3 d标本鲜明对比的阴霾

的方法来减少或消除背景(BG)信号

根据的方式引起的BG out-of-focus-signal处理,我们区分独家和包容的方法。

包容的方法,如宽视野(WF)反褶积显微镜,把光的分布在整个体积考虑和重新分配记录的光子BG起源,从而增加卷记录的信噪比。这个重新分配可以做,因为光来自一个单点的分布所描述的点扩散函数(PSF)。包容的方法达到其极限随着越来越多的光从失焦层结合in-focus-region。光散射等影响,扭曲了PSF,增加BG,使恢复与包容性的方法更加困难。不幸的是,在生物标本散射是不可避免的。因为包容的方法,根据他们的定义,使用所有图像中检测到信号,他们还从失焦过程信号组件层,不应导致最终结果。

独有的方法基于分离的原则,减去不必要的BG的形象,所以只有聚焦的图像层的信号仍然存在。基于成像系统利用硬件防止失焦的光(如旋转磁盘系统或选择性平面照明)或软件和硬件的组合来消除BG组件(网格投影系统)。网格投影系统需要获得多个图像,从而导致运动文物当记录快速移动的样本。此外,他们只能有限的深度,大幅图像的网格需要相机检测到的。金本位消除失焦BG pinhole-based扫描系统。共焦系统排除的针孔光失焦层,所以只有获得焦点的光层到达探测器。雷声成像系统使用计算清算作为独家方法去除BG与单个记录实时图像。因此克服了缺点当成像的生活正如上面提到的样品。

计算结算(CC)

计算清算是雷声成像系统的核心技术。它对每个图像检测和删除失焦BG,让感兴趣的信号直接访问。与此同时,在获得焦点的地区,保持标本的边缘,和强度特性。基于摄像头记录图像时荧光显微镜的“不必要的”BG补充道“想要”的信号获得焦点的结构和总是记录。为达到最佳效果,其目的是尽可能地减少BG。排除不必要的BG的形象,关键是要找到关键标准必须准确区分BG和想要的信号。一般来说,BG行为记录图像中显示了一个特征是独立于它的起源。因此,仅从外观形象,这不是明显的BG来自的地方。特别是在生物样品,BG通常不是常数。很的视野(FOV)变量。 Computational Clearing takes this automatically into account to make the in-focus signal immediately accessible.

用宽视野显微镜获得的图像可以分解为两个部分:内焦距BG的信号。BG主要是因,聚焦信号。因此,一个宽视野的形象,我(r),大约可以给出的:

在哪里psf_/如果(r)和f (r)是有效的获得焦点的点扩散函数(如果)和失焦的贡献和荧光团分布,分别。因为失焦PSF远比获得焦点的一个,这两个在情商的贡献。(1)可以通过length-scale-discriminating明显分离算法,如小波变换。我们开发了一个迭代算法分离这两个贡献。计算下面的每个迭代的最小化:

在这里S [̂_出]代表结构长度尺度的估计的贡献我_出。结构长度范围r₀Eq。(2)基于计算系统的光学参数,可以调整。在拉斯维加斯X软件,它被称为“特性”。

使用这种方法,只有BG移除。信号和噪声从获得焦点的样品感兴趣的领域。因为聚焦的图像的噪声区域,聚焦的图像的边缘特征图像中可见,因此维护样本特性之间的空间关系对他们的特性。的相对强度特性仍然是守恒的,尽管在生命科学性质不同BG典型样本。

与传统的方法,图像显示使用计算结算不是生成的,而是“揭露”的背景信号的样本。

计算清算消除了BG,清楚地揭示焦平面深处样本。计算结算,作为独家方法,实际上变得更强大包容性方法结合使用。

雷声成像系统提供三种模式可供选择:

1. 即时计算清算(ICC),
2. 小体积计算结算(SVCC)和
3. 大量计算结算(LVCC)。

即时计算结算(ICC)是一个同义词的独家计算结算方法首次引入初这一技术。SVCC和LVCC独家的组合计算清算和包容性decision-mask——基于3 d反褶积致力于薄样品(SVCC)或厚样品(LVCC)。包容性的自适应图像信息提取方法是一个进化的概念从闪电,徕卡微系统的自适应反褶积方法,最初为共焦显微镜开发。

闪电使用面具作为基本参考决定计算一组适当的参数为每个图像体素。结合宽视野PSF,完全自动化的功能内在的闪电自适应反褶积过程可以被转移到宽视野检测。

实验证据

在本节中,实验数据显示说明:

1. 如何用雷轰成像系统生成的数据是可量化;
2. 如何计算清算允许成像深处一个样本;
3. 图像分辨率的改善达到与雷声成像系统。

量化宽视野数据与计算清算

InSpeck珠子是微球标准生成一系列的定义——荧光强度水平构造校正曲线和评估样品的亮度。在这个简短的实验中,同等体积的才荧光和荧光珠混合在一起。荧光珠有不同的相对强度。100%,35%,14%,3.7%,1%,0.3%。

InSpeck珠子沉积到盖玻片和156个职位在使用20 x低钠目标(图3中,单独的z位置)。三个通道记录从左到右(图3):亮视场(BF),
相差(PH)和荧光(氟)。氟强度调整以避免饱和明亮物体的摄像头传感器。为潜在的非均匀照明,正确的中心区域
FOV使用。不需要进行进一步的平面场校正。氟图片进行后期处理,即时计算结算(ICC)使用功能规模对应于珠大小的2500海里。

珠子被发现通过简单的PH值阈值图像。纠正错误检测到珠子,只有圆的对象(≥0.99圆度)一定规模(68到76像素)被接受。这个面具是用来获得的平均强度原始荧光和ICC处理渠道。没有排除强度异常值。相对价值,所有接受了珠子的原材料强度除以人口中等强度的最大强度相对强度的荧光珠(通常是100%)。在图4中(右),黑色线表明,计算清算后,强度仍出现在预期的值。

结论:计算清算允许真正的荧光动力学的珠子是杰出的,即使对于weakest-signal人口不可见的原始数据。量化的发射强度使用计算结算时很容易完成。然而,对于这种类型的实验,定量荧光显微镜需要良好的实践是非常密切。

量化宽视野数据与计算清算二世

下面的实验显示了刑事法院如何处理巨大的差异和BG的异质性。人口green-fluorescent-bead不同强度的准备和分散到盖玻片。混合强度的珠子出现,但在集群(图6中,左)。一般BG提供了通过消除激发过滤器过滤数据集和添加荧光素BG的一半thecover滑用记号笔标记。两个同样大小的区域重叠fov定义:一个在该地区与荧光素、高BG瓷砖扫描(图5:区域(左),和其他在该地区没有它,低BG瓷砖扫描(图5:地区B)。

对于每个视场,男朋友的珠子被简单的阈值确定图像(图6中,左)。从这个面具,原始的平均荧光强度和ICC-processed图像。

物体的强度分布在区域(高BG)和B(低BG)非常独特(Kolgomorov斯米尔诺夫距离:0.79±0.2,置换重采样)。偏移量和添加的BG可以看到(图7中,左蓝)。相同的数据分析计算清算后显示了一个非常相似的分布(KS: 0.05±0.02)这两个地区。

结论:计算结算可以处理异构BG信号固有的生物标本的图像数据。此外,它允许量化的荧光信号,无需繁琐的地方除BG算法通常需要调整为每个成像会话(即使是同一个对象)。

量化宽视野数据与计算清算三世

进一步显示了ICC的线性行为,稳定的荧光图像对象(15μm珠子)在一个固定FOV记录增加曝光时间。排除illumination-onset效果,被照亮的对象不断的激发光。由于低密度的珠子和平坦,原始图像的背景起源主要来自相机抵消。ICC参数设置根据对象尺寸:15μm强度最高(100%)。

对象(n = 107)被发现在最长的暴露(160毫秒),处理图像(图8中,绿点)。对象包含4像素内的所有像素距离当地最大的强度大于20%最大。数据是高度线性(图9,左,r > 0.999单一对象的测量)。各自的平均值,形象化强度除以曝光时间和强度对应于最长的曝光时间。原始数据显示,BG的相对数量减少和增加的信号,这是正确的,随着BG来源主要是常数相机抵消(图9中,中心蓝色)。然而,处理过的数据显示一个线性行为(图9中,中心红色)。

最后,刑事法庭与传统BG-subtracted数据。这一步通常是强制性的强度的量化。object-free区域的平均强度(100 x 100像素,如图8所示,红场)计算每个图像和减去从强度数据相同的图像。策划的平均强度以前发现的对象与传统BG-subtracted原始数据
表明,刑事法庭给出相同的结果(图9,对吧)。结论:刑事法庭展示了一个线性行为。它使数据量化,无需进一步的图像处理,可以乏味,尤其是在非均匀背景。

的最大深度成像高度依赖样本。因素,如荧光团的密度、吸收、或局部折射率在样本的同质性,直接影响散射光的信噪比和数量每体素。这些因素通常波动,即使在相同的视野。

经典的方式实现光学切片的三维样本在基于成像系统是使用多点照明,如Nipkow磁盘或grid-projecting设备。后者介绍了工件在网格不能预计大幅焦平面。基于磁盘系统,另一方面,必须处理的有限距离小孔,介绍光污染失焦的飞机在特定的成像深度。

计算清算,最大深度足够透明的样品主要取决于发射光的散射。计算清算使深度成像通过消除散射光组件。如果至少有一些在当地可以实现图像的对比,雷声成像系统使其可访问。计算清算的很大的优势是,它适用于活标本,所以成像可以在生理条件下完成。

更好的contrast-to-noise比率,重建的结果就会越好。对于示例如图10所示,大量计算结算(LVCC),计算清算和自适应反褶积的组合,用于图像厚样本体积。在样品的上层,甚至最好的细节,可以分段解决。尽管分辨率和分割可能减少深层,成像的深度140 - 150μm示例(图11)中显示了大量的有价值的原始数据细节没有透露。没有打雷,停在最宽视野成像的实验的深度50μm,相信没有更多的信息可以被检索。

应用小体积计算结算(SVCC)单身,重叠,导致决议增强衍射极限对象,如下所示如图12所示。在给定的例子一个珠40 nm直径是成像(100 x 1.45 NA目标)和SVCC默认设置。结果是一个横向分辨率增强* 2 *(比FWHMX SVCC /原始= 0.51)和2.5倍以上轴向(比FWHMZ SVCC /原始= 0.39)。

*分辨率增强定义为一个点光源发射的表观尺寸。分离两种结构接近对方折射下限制是不可能的。

从徕卡微系统计算清算,独家方法,有效区分和消除背景从想要的信号。万博体育它的核心技术是雷声成像仪的家庭。

不同的实验与适当的样品给了证据表明计算清算允许对宽视野图像定量分析。结合自适应反褶积,它允许将分辨率增强。雷声成像系统允许在大量样品中深层成像,如组织、生物模型或三维细胞培养。雷声成像仪成为强大的成像解决方案,最大化的信息从3 d中提取样本。