分辨率和数值孔径
数值孔径(NA)与光通过的介质的折射率(n)以及给定物镜的角孔径(α) (NA= n x sin α)有关。显微镜的分辨率并不仅仅取决于物镜的NA，而是整个系统的NA，考虑到显微镜聚光镜的NA。更多的图像细节将在一个显微镜系统其中所有光学元件都正确对齐，具有相对较高的NA值，并且相互之间工作和谐。分辨率还与用于成像标本的光的波长有关;波长较短的光比波长较长的光能分辨更多的细节。
在处理分辨率时需要考虑三个数学概念:“阿贝衍射极限”、“艾里圆盘”和“瑞利准则”。下面将按时间顺序逐一介绍。
乔治·比德尔·艾里和“艾里唱片”(1835年)
乔治·比德尔·艾里(1801-1892)，英国数学家和天文学家。1826年(25岁)，他被任命为三一学院的数学教授，两年后，他被任命为新剑桥天文台的天文学教授。从1835年到1881年，他是“皇家天文学家”，月球和火星上有一个陨石坑以他的名字命名。
同样是在1835年，他在《剑桥哲学学会会刊》上发表了一篇论文，题为《圆孔玻璃物体的衍射》。艾里从一个天文学家的角度写了这篇论文，他在文章中描述了“在好的望远镜中看到的围绕恒星图像的环或射线的形式和亮度”。尽管写在不同的科学领域，这些观察结果与其他光学系统有关，实际上，与显微镜有关
一个艾里斑在衍射限制的完美对齐系统中，由圆形孔径确定的最佳聚焦点。从上面看(图1)，这似乎是一个明亮的光点，周围是同心环或波纹(更准确地称为an通风模式）.
衍射图样是由光的波长和光通过的孔径大小决定的。艾里圆盘的中心点包含了大约84%的发光强度，剩下的16%在这个点周围的衍射图样中。当然，在显微镜下观察标本时，会有许多光点，从大量艾里图案的角度考虑更合适，而不是从术语“艾里圆盘”所描述的单个光点的角度考虑。
图1下半部分所示的艾里图案的三维表示也被称为“点扩散函数”。
恩斯特·阿贝和“阿贝衍射极限”(1873年)
恩斯特·卡尔·阿贝(1840-1905)是一位德国数学家和物理学家，1866年，他遇到了卡尔·蔡司，他们一起创立了所谓的“蔡司光学工厂”，现在被称为蔡司。此外，他还在1884年共同创立了Schott Glassworks。阿贝也是第一个定义这个词的人数值孔径．1873年，阿贝发表了解释显微镜衍射极限的理论和公式。阿贝认识到标本图像是由大量重叠的、多强度的、衍射有限的点(或艾里圆盘)组成的。
为了增加决议(d=λ/2 NA)，试样必须用较短的波长(λ)光或通过成像介质具有相对较高的亮度折射率或与光学元件有高NA(或者，实际上是所有这些因素的组合)。
然而，即使考虑到所有这些因素，由于整个系统的复杂性、玻璃在400 nm以下波长的透射特性以及在完整显微镜中实现高NA，在实际显微镜系统中的限制仍然有所限制。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm(分辨率限制的例子，请参阅下面)。
约翰·威廉·斯特拉特和《瑞利标准》(1896)
约翰·威廉·斯特拉特，第三代瑞利男爵(1842-1919)，英国物理学家和多产作家。在他的一生中，他发表了惊人的466篇论文，其中包括430篇科学论文。他写了很多不同的主题，如鸟类飞行、心理研究、声学。1895年，他发现了氩(他后来因此在1904年被授予诺贝尔物理学奖)。
瑞利以乔治·艾里的理论为基础，在1896年发明了“瑞利标准”理论。瑞利判据(图2)定义了衍射有限系统中的分辨率极限，换句话说，当两个光点彼此可分辨或分辨时。
利用艾里盘理论，如果来自两个单个艾里盘的衍射图样不重叠，那么它们很容易被区分，“很好分辨”，并被认为满足瑞利判据(图2，左)。当一个艾里圆盘的中心与另一个艾里圆盘衍射图样的第一个最小值直接重叠时，它们可以被认为是“刚刚解决”的，并且仍然可以作为两个独立的光点区分(图2，中间)。如果艾里圆盘比这更近，那么它们就不符合瑞利准则，并且“不被解析”为两个不同的光点(或样本图像中的独立细节;图2，右)。
如何计算显微镜的分辨率
考虑到上述所有理论，很明显，在计算分辨率的理论极限时，有许多因素需要考虑。分辨率也取决于样品的性质。让我们看看用阿贝衍射极限和瑞利判据来计算分辨率。
首先，应该记住:
NA= nxsin α
其中n为成像介质的折射率，α为物镜角孔径的一半。物镜的最大角孔径约为144º。这个角的一半的正弦值是0.95。如果使用带有折射率为1.52的油的浸没物镜，物镜的最大NA将为1.45。如果使用“干式”(非浸入式)物镜，物镜的最大NA将为0.95(因为空气的折射率为1.0)。
横向(即XY)分辨率的Abbe衍射公式为:
d= λ/2 NA
其中λ是用于对样品成像的光的波长。如果使用514 nm的绿光和NA为1.45的油浸物镜，那么(理论)分辨率的极限将是177 nm。
Abbe衍射轴向(即Z)分辨率公式为:
d= 2 λ/NA2
同样，如果我们假设波长为514 nm，观察物镜NA值为1.45的标本，则轴向分辨率将为488 nm。
瑞利判据是根据阿贝衍射极限略微改进的公式:
R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
其中λ是用于对样品成像的光的波长。NAobj是目标的NA。NAcond为冷凝器的NA。“1.22”这个数字是一个常数。这是从瑞利关于贝塞尔函数的工作中推导出来的。这些是用于计算系统中的问题，如波传播。
考虑到凝汽器的NA，一般情况下，空气(折射率为1.0)是凝汽器与玻片之间的成像介质。假设冷凝器的角孔径为144º，那么NAcond值将等于0.95。
如果使用514 nm的绿光，NA为1.45的油浸物镜，NA为0.95的聚光镜，那么(理论)分辨率的极限将是261 nm。
如上所述，用于成像标本的光的波长越短，就能分辨出越多的细节。因此，如果使用最短可见光波长为400 nm, NA为1.45的油浸物镜和NA为0.95的聚光镜，那么R将等于203 nm。
为了在显微镜系统中达到最大(理论)分辨率，每个光学组件都应该具有最高的可用NA(考虑到角孔径)。此外，使用较短波长的光来观察标本将提高分辨率。最后，整个显微镜系统应正确对齐。
